聚凝胺是一種多聚陽離子聚合物，常用于哺乳動物細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染實驗以增強脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。Polybrene目前廣泛用于逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，作用機(jī)理可能是通過中和細(xì)胞表面唾液酸與病毒顆粒之間的靜電排斥從而促進(jìn)吸附作用。Polybrene也是一種有名的抗肝素劑(肝素拮抗劑)，常用來生產(chǎn)非特異性凝集的紅細(xì)胞。
另外Polybrene也多用于蛋白測序，因為小劑量的Polybrene在自動測序分析可明顯改善多肽的降解現(xiàn)象。PVDF膜加入polybrene還能提高膜的親和性。
實驗1：逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(Retroviral Infection)
(1)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒原液的制備：取5ml生長培養(yǎng)基(5%血清)加入約含單層轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄包裝細(xì)胞的100mm培養(yǎng)盤內(nèi)。孵育24h后，吸去培養(yǎng)液并用0.45μm濾器過濾。
(2)待感染細(xì)胞的培養(yǎng)：100mm培養(yǎng)盤內(nèi)加入10ml*培養(yǎng)基，細(xì)胞密度為5×105/盤。
(3)病毒感染：細(xì)胞培養(yǎng)24h后，吸去*培養(yǎng)液。用含polybrene的2ml病毒上清 (或?qū)⒉《驹合♂尩?ml)感染細(xì)胞，polybrene的終濃度為5μg-10μg/ml。37℃孵育3-6h。
(4)收集病毒顆粒：加入8ml*培養(yǎng)基。感染3天后，按照1:5的比例用選擇培養(yǎng)基裂解細(xì)胞。
實驗2：轉(zhuǎn)染
(1)*生長培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞密度約50%;
(2)孵育細(xì)胞18-24h后準(zhǔn)備DNA-培養(yǎng)基- Polybrene混合液，按如下操作制備混合液：①添加*培養(yǎng)基(60mm培養(yǎng)皿2ml，100mm培養(yǎng)皿3ml)，37℃預(yù)熱;②添加10ng~10µg質(zhì)粒輕輕混勻;③加入Polybrene至終濃度為5μg-10μg/ml。輕輕混勻。以上每個成分需要按順序加入。
(3)去除培養(yǎng)基，在細(xì)胞中加入DNA-培養(yǎng)基-Polybrene溶液，在37℃孵育細(xì)胞6-20h。細(xì)胞培養(yǎng)的前6h內(nèi)約每1.5h輕柔混勻。
(4)去除DNA-培養(yǎng)基-Polybrene溶液。用DMSO shock solution(15%DMSO in 1X HBSS)輕輕蓋住細(xì)胞(60mm培養(yǎng)皿3ml，100mm培養(yǎng)皿4ml)。每次加入溶液時用手輕晃培養(yǎng)盤10s，使得液體均勻分布。然后37℃孵育細(xì)胞4min。
(5)立即去除DMSO shock solution，用*生長培養(yǎng)基輕輕清洗細(xì)胞2次。對于60mm培養(yǎng)皿每次用5ml培養(yǎng)液清洗，100mm培養(yǎng)皿每次用10ml培養(yǎng)液清洗。
(6)加入*培養(yǎng)基到細(xì)胞中;
(7)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化：去除生長培養(yǎng)基，按照1:5的比例用選擇培養(yǎng)基裂解細(xì)胞。
瞬時表達(dá)：去除生長培養(yǎng)基，加入新鮮的生長培養(yǎng)基。24-72h后收獲細(xì)胞。