JC-10 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit

JC-10線粒體膜電位檢測試劑盒

溫馨提示：見我司整理線粒體熒光探針產(chǎn)品專題。

產(chǎn)品標簽

Rhodamine 123 羅丹明123；JC-1；JC-10；CCCP；CAS：62669-70-9

訂購信息：

產(chǎn)品描述

JC-10線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit）是一種以JC-10為熒光探針，快速且靈敏的檢測細胞、組織或純化線粒體膜電位變化的試劑盒。因線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。因此本試劑盒可用于早期的細胞凋亡檢測。

JC-10是一種新型的用來監(jiān)測線粒體膜電位變化的熒光探針，是JC-1的*替代物。與JC-1相比，具有以下幾個重要優(yōu)勢：1）溶解性得以改良——在水溶液中形成沉淀可能性明顯降低；2）使用更方便——簡化步驟將手動操作時間zui小化；3）熒光信號更高——改良的信號與背景熒光的信噪比；4）結(jié)果更穩(wěn)定——優(yōu)化探針以保證更連續(xù)性和穩(wěn)定性結(jié)果。

JC-10是一種替換JC-1，用于檢測線粒體膜電位△Ψm的理想熒光探針。JC-10以電勢依賴性的方式積聚在線粒體內(nèi)，可以用來檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。正常線粒體內(nèi)，JC-10聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，聚合物發(fā)出強烈的紅色熒光（Ex=540 nm, Em=590 nm）；不健康的線粒體由于膜電位的下降或喪失，JC-10只能以單體的形式存在于胞漿中，產(chǎn)生綠色熒光（Ex=490 nm, Em=525 nm）。JC-10不僅可用于定性檢測，因顏色的變化可以非常直接的反映出線粒體膜電位的變化。也可以用于定量檢測，因線粒體的去極化程度可以通過紅/綠熒光強度的比例來衡量。

本試劑盒提供CCCP用作線粒體膜電位喪失的陽性對照。對于六孔板樣品，本試劑盒可檢測100個樣品。

產(chǎn)品包裝

注意事項

1）    JC-10（200×）在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

2）    裝載完JC-10后用JC-10染色緩沖液（1×）洗滌時，使JC-10染色緩沖液（1×）保持4℃左右，此時洗滌效果較好。

3）    JC-10探針裝載完并洗滌后盡量在30min內(nèi)完成后續(xù)檢測。在檢測前需冰浴保存。

4）   請勿把JC-10染色緩沖液（5×）全部配制成JC-10染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用JC-10染色緩沖液（5×）。

5）    如果發(fā)現(xiàn)JC-10染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，可在37℃加熱促進溶解。

6）    CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小心防護。

7）    為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

1.      JC-10染色工作液制備

對于六孔板，每孔所需 JC-10 染色工作液的量為1ml，其他培養(yǎng)器皿的JC-10 染色工作液的用量以此類推；對于細胞懸液每50～100萬細胞需0.5mL JC-10染色工作液。

2.      陽性對照的設置

CCCP（10mM）推薦按1∶1000 的比例加入到細胞培養(yǎng)液中，稀釋至10μM，處理細胞20min。隨后按照下述方法裝載JC-1，進行線粒體膜電位的檢測。

對于大多數(shù)細胞，通常10μM CCCP處理20 min后線粒體的膜電位會*喪失，JC-10 染色后觀察應呈綠色熒光；而正常的細胞經(jīng)JC-10 染色后應顯示綠橙色熒光。對于特定的細胞，CCCP 的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻資料決定。

3.      對于懸浮細胞

1）   取10～60萬細胞，重懸于0.5mL 細胞培養(yǎng)液中，細胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。

2）   加入0.5mL JC-10 染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20min。

3）   孵育期間，按照每1mL JC-10 染色緩沖液（5×）加入4mL 蒸餾水的比例，配制適量的JC-10 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

4）  37℃孵育結(jié)束后，600×g4℃離心3～4min沉淀細胞。棄上清，注意盡量不要吸除細胞。

5）   用JC-10 染色緩沖液（1×）洗滌2 次：加入1mL JC-10 染色緩沖液（1×）重懸細胞，600×g4℃離心3～4min沉淀細胞，棄上清。再加入1mL JC-10 染色緩沖液（1×）重懸細胞，600×g4℃離心3～4min沉淀細胞，棄上清。

6）   再用適量JC-10 染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細胞儀分析。

4.      對于貼壁細胞

【注意】：對于貼壁細胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細胞儀檢測，可以先收集細胞，重懸后參考懸浮細胞的方法進行檢測。

1）   對于六孔板的一個孔，吸除培養(yǎng)液，根據(jù)具體實驗如有必要可用PBS 或其它適當

5.      對于純化的線粒體

1）   將配制好的JC-10 染色工作液再用JC-10 染色緩沖液（1×）稀釋5 倍。

2）   0.9mL 5 倍稀釋的JC-10 染色工作液中加入0.1mL 總蛋白量為10～100μg 純化的線粒體。

6.      熒光觀測和結(jié)果分析

檢測 JC-10 單體時可以把激發(fā)光設置為490nm，發(fā)射光設置為525nm；檢測JC-10聚合物時，可以把激發(fā)光設置為540nm，發(fā)射光設置為595nm。

【注1】：此處測定熒光時不必把激發(fā)光和發(fā)射光設置在大激發(fā)波長和大發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測JC-10聚合物時可使用常來檢測TRITC用的標準帶通濾波器。檢測JC-10單體可使用常來檢測FITC或GFP的標準帶通濾波器。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細胞很可能處于細胞凋亡早期。出現(xiàn)綠橙色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細胞的狀態(tài)也比較正常。

【注2】：由于紅色的JC-10信號淬滅比綠色快，所以用標準帶通濾波器檢測時先檢測紅色熒光。

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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JC-10線粒體膜電位檢測試劑盒 細胞凋亡

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