FerroFarRed (Fe²⁺indicator) 亞鐵離子熒光探針

產(chǎn)品標(biāo)簽

FerroFarRed；FeRhoNox-1；FerroOrange；Labile ferrous ion 不穩(wěn)定鐵(II)離子；Fe2+熒光探針Ferroptosis 鐵死亡；C11 BODIPY 581/591 脂質(zhì)過(guò)氧化探針；

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

FerroFarRed，也稱為SiRhoNox-1、ER-SiRhoNox，是一種特異性檢測(cè)不穩(wěn)定的鐵(II)離子（Fe2+）的熒光探針。FerroFarRed基本無(wú)熒光，一旦與Fe2+反應(yīng)后，不可逆的生成一種遠(yuǎn)紅熒光產(chǎn)物（Absmax=646nm，F(xiàn)Lmax=662nm，圖1. FerroFarRed的光譜特征）。生理濃度下的鐵（III）離子（Fe3+）或其它除鐵離子以外的二價(jià)金屬離子都不會(huì)使其熒光增強(qiáng)（見(jiàn)圖2. FerroFarRed的金屬離子反應(yīng)特異性）。FerroFarRed具細(xì)胞膜滲透性和高選擇性，且在高達(dá)100μM的濃度下對(duì)細(xì)胞幾乎無(wú)毒性，適用于活細(xì)胞內(nèi)Fe2+的檢測(cè)，傾向定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）。適用于熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、熒光酶標(biāo)儀以及流式細(xì)胞儀（配置紅色激光器）分析。

圖1.FerroFarRed的光譜特征。FerroFarRed在0.05M HEPES buffer，pH 7.4下的吸收光譜（左）和熒光光譜（右）。FerroFarRed的吸收波長(zhǎng)在646nm，而熒光波長(zhǎng)在662nm。

圖2.FerroFarRed的金屬離子反應(yīng)特異性。FerroFarRed（5 μM）與各種金屬離子反應(yīng)后，用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)：630nm，發(fā)射波長(zhǎng)665nm）?？梢?jiàn)，僅與Fe2+反應(yīng)后發(fā)生顯著的熒光增強(qiáng)。

保存與運(yùn)輸方法

保存：≤-20℃避光干燥保存，至少1年有效。

運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1）   FerroFarRed傾向定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，但也可能檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)池內(nèi)的Fe2+，目前針對(duì)這一點(diǎn)未做明確評(píng)估。

2）   熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

3）   為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說(shuō)明

一、 需要自行準(zhǔn)備的材料

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)或超純DMSO（比如：MS4601A-100ML）【強(qiáng)烈建議將高純的DMSO分裝成單次用量保存在極低溫冷凍室內(nèi)，比如-80℃，避免吸潮。降解的DMSO可能會(huì)增加FerroFarRed的背景信號(hào)】

1.2 合適的觀察緩沖液（比如：PBS, pH 7.4；HBSS；等）。不要含酚紅。

1.3    無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基（D-MEM等）

二、探針準(zhǔn)備

2.1從冰箱取出FerroFarRed，置于室溫回溫至少30min，將其置于微量離心機(jī)內(nèi)低速離心。將瓶?jī)?nèi)的粉末離心到管底后，再開(kāi)蓋。

2.2 往一管FerroFarRed（50nmol）內(nèi)加入50μl 高質(zhì)量DMSO，用槍反復(fù)吹吸5次或以上，使其完quan溶解即得到1mM FerroFarRed儲(chǔ)存液。【注意：FerroFarRed是藍(lán)色固體，但溶液幾乎無(wú)色（淺藍(lán)色）】。建議單次用完儲(chǔ)存液，若實(shí)在用不完，請(qǐng)根據(jù)單次用量分裝，置于-80℃避光保存。用中性緩沖液來(lái)稀釋儲(chǔ)存液。

三、HeLa細(xì)胞Fe2+的染色步驟（熒光成像分析）

3.1 在玻底培養(yǎng)皿內(nèi)接種細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜。

3.2從培養(yǎng)皿內(nèi)吸走培養(yǎng)基，用合適的觀察緩沖液（比如：HBSS）清洗兩次。

3.3 用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋1uM FerroFarRed儲(chǔ)存液，制備成5mM的染色工作液。

3.4 將染色工作液加入培養(yǎng)皿內(nèi)，于37℃孵育1h。

【注意：①建議根據(jù)細(xì)胞類型和自身實(shí)際需求優(yōu)化工作濃度和孵育時(shí)間。②如果細(xì)胞很容易從培養(yǎng)皿上脫落，建議使用多聚L-賴氨酸或其它包被基質(zhì)包被的培養(yǎng)皿來(lái)接種細(xì)胞?！?/p>

3.5 染色后用觀察緩沖液（比如：HBSS）清洗一次，替換成新的觀察緩沖液。

3.6 在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。

四、HepG2細(xì)胞Fe2+的測(cè)定（流式分析）

4.1 于多孔培養(yǎng)板內(nèi)接種細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)。

4.2 從培養(yǎng)板內(nèi)吸走培養(yǎng)基，用合適的觀察緩沖液（比如：HBSS）輕輕的清洗兩次。

4.3 用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋1uM FerroFarRed儲(chǔ)存液，制備成5mM的染色工作液。

4.4 將染色工作液加入培養(yǎng)板內(nèi)，于37℃孵育1h。

【注意：建議根據(jù)細(xì)胞類型和自身實(shí)際需求優(yōu)化工作濃度和孵育時(shí)間?！?/p>

4.5 染色后，用PBS清洗一次，之后加入0.25% yi酶-EDTA消化細(xì)胞。

4.6 于冰上用PBS稀釋0.25% yi酶-EDTA，之后500 x g離心細(xì)胞懸液5min，以沉淀細(xì)胞。

【注意：不可用血清來(lái)中和yi酶。】

4.7 吸走上清，用PBS重懸細(xì)胞。

4.8 用細(xì)胞篩網(wǎng)（40μm尼龍篩網(wǎng)）過(guò)濾細(xì)胞，去除細(xì)胞碎片。

4.9 上機(jī)，流式細(xì)胞儀分析。

五、熒光檢測(cè)

對(duì)于激光激發(fā)：635nm波長(zhǎng)左右的激光器比較適合。熒光在660nm左右觀察。

對(duì)于熒光顯微鏡觀察：選擇檢測(cè)Cy5的紅色激發(fā)濾片。對(duì)于流式分析，選擇檢測(cè)APC的濾片。

相關(guān)產(chǎn)品

FerroFarRed的染色示例（來(lái)自文獻(xiàn)）

Ref 1. Li Z, Jiang L, Chew SH, et al. Carbonic anhydrase 9 confers resistance to ferroptosis/apoptosis in malignant

mesothelioma under hypoxia. Redox Biology. 2019 Sep;26:101297. DOI: 10.1016/j.redox.2019.101297. PMID:

31442913; PMCID: PMC6831888.

檢測(cè)方法（Fe(II)的細(xì)胞定位）：Catalytic Fe(II) was detected with a fluorescent turn-on probe, SiRhoNox-1 (FerroFarRed;), as previously described. Cells (5?×?104) were cultured in normoxia on 35-mm glass bottom dish  for 16?h?at 37?°C. After treatment with CA9 inhibitors under hypoxia for 48?h, cells were co-stained with 5?μM of SiRhoNox-1 and 200?nM of LysoTracker Green in FluoroBrite DMEM for 30?min?at 37?°C in normoxia, followed by incubation with 75?nM of MitoTracker Red for another 30?min. We confirmed that 1-h incubation in FluoroBrite DMEM containing 0.1?mg/L (0.25?μM) Fe(NO3)3 scarcely affects iron metabolism of the cells within this limited period. Medium was replaced with new FluoroBrite DMEM, followed by observation with a confocal microscope (LSM880, Carl Zeiss; Oberkochen, Germany). The excitation/emission used for SiRhoNox-1, LysoTracker and MitoTracker probes were 633/670, 504/511 and 579/599?nm, respectively. Local signal intensity of the regions overlapped with each organelle-trackers were analyzed with ZEN Imaging Software (Carl Zeiss).

Fig. 1  CA9 overexpression in MM cells correlates with increased catalytic Fe(II) in response to hypoxia. (F) Differential levels of catalytic Fe(II) in normoxia or hypoxia of ACC-Meso-1?cells were determined by staining with SiRhoNox-1 (5?μM), followed by evaluation with a flow cytometer after 48 h-incubation. (G) Localization of catalytic Fe(II) in normoxic or hypoxic ACC-Meso-1?cells were analyzed by co-staining of SiRhoNox-1 (5?μM), LysoTracker (200?μM) and MitoTracker (75?μM) after 48 h-incubation and observation with a confocal microscope. Integrated intensity per cell (N?=7) was quantified by ZEN Imaging Software (ZEISS) (means ± SEM; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P<?0.001 vs each control unless indicated by bar). Refer to text for details. SM, sarcomatoid mesothelioma; EM, epithelioid mesothelioma; N, normoxia; H, hypoxia; A.U., arbitrary unit.

— —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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